Biotechnology / Систему генетического редактирования «спящая красавица» научили работать почти без осечек







 




	
	
	
			
			
	
    
	

		
	
	
    
    
	

	
	
	
	
		
	
	
	





	





Пожалуйста, не используйте Microsoft Internet Explorer! Для корректной работы сайта используйте любой другой браузер.

Систему генетического редактирования «спящая красавица» научили работать почти без осечек

Источник www.freepik.com
Немецкие биологи усовершенствовали систему редактирования генома «спящая красавица» — это способ доставки генов в клетку на основе мобильных элементов. Новый вариант метода позволяет избежать бесконтрольного встраивания «груза» в геном. Он работает как на взрослых, так и на стволовых клетках, а технология генной терапии CAR-T с его применением становится быстрее и безопаснее.
6 November 2019

Самый простой способ редактировать геном — использовать вирусы, которые своим существованием обязаны умению «вписывать» свои гены в чужую ДНК. На основе обезвреженных вирусов, или вирусных векторов, работают все одобренные для применения методы генной терапии. Однако у этого способа есть свои минусы: например, вирусы иммуногенны, и даже обезвреженная их версия вызывает иммунную агрессию, поэтому возможно отторжение отредактированных клеток.

В последнее время все большую популярность набирают методы «точечного редактирования» — это, например, система CRISPR/Cas9 или «цинковые пальцы». Эти системы позволяют встраивать «груз» не в случайное, а в строго определенное место на хромосоме. Но и у них есть недостатки: они то и дело промахиваются (это называют нецелевым редактированием), а еще не позволяют встроить в геном достаточно большой груз.

Есть и третье направление редактирования генома — с помощью мобильных генетических элементов, или транспозонов. Это участки ДНК, которые способны вырезать себя из одного места генома и встроить в другое — для этого они кодируют фермент транспозазу. Многие такие последовательности в нашем геноме потеряли активность со временем. Но в 1997 году ученые восстановили один из предковых вариантов транспозазы, который «замолчал» в геноме рыб миллионы лет тому назад — и назвали его «спящей красавицей», в честь долгого «сна» и внезапного «пробуждения».

«Спящую красавицу» уже пробовали использовать на клетках человека, и некоторые технологии с ее применением дошли до 1-2 фазы клинических испытаний. Эта система редактирования устроена следующим образом: в клетку вводят плазмиду (кольцевую ДНК) с геном транспозазы и другую плазмиду — с «грузом». Клетка производит транспозазу, а та распознает «груз», отрезает его от плазмиды и вносит разрывы в ДНК, на место которых встраивается груз.

Эта система работает эффективно, но с ней есть одна трудность: она не позволяет контролировать работу транспозазы — сколько раз она сумеет встроить «груз» в геном и не попадет ли вместе с ним что-то лишнее. Поэтому клетки, которые редактируют таким способом, после этого долго — до месяца — культивируют, чтобы убедиться в том, что в них не возникло лишних мутаций. Но не каждый пациент — особенно, если речь идет о CAR-T терапии, когда в иммунные клетки «вживляют» рецептор для опухолевых белков — может прождать так долго.

Ирма Керкес (Irma Querques) и ее коллеги из Европейской молекулярной биологической лаборатории (EMBL) в Гейдельберге разработали новый вариант системы на основе «спящей» красавицы. Они предложили вводить в клетку не плазмиду с ферментом транспозазой, а белок в чистом виде. Предыдущие попытки этого добиться закончились неудачей, потому что транспозаза слипается в комки и плохо проходит через мембрану.

Исследователи заменили две аминокислоты в составе транспозазы, что сделало белок более растворимым в воде. Полученную «гипер-растворимую» транспозазу они поместили в клетки с помощью электропорации и сравнили результат с обычной плазмидой: чистый белок постепенно исчез из клеток в течение суток, а плазмида оставалась на месте по меньшей мере 5 дней. Это означает, что действие «усовершенствованной» транспозазы будет коротким, а следовательно, она сможет внести меньше лишних мутаций в геном.

Ученые опробовали свой метод на опухолевых клетках HeLa, затем на эмбриональных стволовых и на кроветворных клетках. И только после этого решили применить его в реальной технологии — CAR-T. Исследователи взяли человеческие Т-клетки и внесли в них ген химерного рецептора, который распознает В-клеточную лимфомы. Эффективность встраивания получилась около 20-30 процентов — примерно такая же, как и в реальной технологии CAR-T, которую применяют в клинике и которая основана на вирусной доставке гена.

В культуре отредактированные клетки уничтожили более 60 процентов опухолевых клеток на своем пути, а также вылечили больных лимфомой мышей в течение недели. При этом в каждой Т-клетке ученые обнаружили около 5 встраиваний гена в ДНК — это в два раза меньше, чем если бы в клетку попала кольцевая ДНК с геном транспозазы. Кроме того, ген примерно в четверти случаев встроился в «безопасные» места генома — это примерно так же часто, как если бы он встраивался случайным образом, и в 8,5 раз чаще, чем векторы на основе ВИЧ.

Авторы работы отмечают, что их новая система может продвинуть редактирование с помощью транспозазы в клинических исследованиях. Она работает безопаснее, чем предыдущие аналогичные методы, но позволяет переносить больший груз, чем точечные редакторы вроде CRISPR/Cas9. Идеальным вариантом, по мнению исследователей, стала бы синтетическая конструкция, которая сочетает в себе точность CRISPR/Cas9 и низкое число осечек транспозазы.

Источник https://www.nature.comhttps://nplus1.ru